三七總皂苷對老年性癡呆大鼠空間探索學習記憶力的影響

鐘振國 屈澤強 鮑運平 王乃平 張鳳芬 張要艷

          (廣西中醫學院 廣西530001)

摘要:目的探討三七總皂(PNS)對老年性癡呆(AD)模型大鼠空間學習記憶功能障礙的改善作用。方法以D一半乳糖腹腔注射致亞急性損傷合并鵝膏草氨酸損毀雙側大腦Meynert基底核建立AD大鼠動物模型;Mom。水迷宮進行學習記憶能力檢測。結果PNS高、低劑量組大鼠在Morris水迷宮測試中，逃避潛伏期明顯縮短，尋求次數、原平臺象限比、跨越原平臺次數明顯增加，與模型組比較有顯著意義(P<0.05)a結論PNS對AD模型大鼠空間學習記憶損害具有明顯改善作用。

關鍵詞:三七總皂;老年性癡呆;動物模型;Morris水迷宮。水迷宮;學習與記憶;大鼠

中圈分類號:8285. 5

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer' sdisease , AD )，是一種大腦神經退行性疾病，65歲以上人群發病率約3%}5%，隨著世界人口逐年老化，其發病率也在不斷上升，但目前仍缺乏有效的防治藥物和方法。三七為五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng ( Burk )  F. H.Chen的根，傳統中醫理論認為其性味甘、微苦、溫，歸肝胃經，具有化痕、止血、活血定痛之效，現代藥理研究表明，三七對心血管系統、血液系統、免疫系統、神經系統等均有不同的藥理作用，而對神經系統損害的保護作用尤引人注目。三七的藥理活性成分的研究主要集中在三七皂貳成分和氨基酸。為此，我們應用Morris水迷宮( Morris water maze,  MWM)評價T三七總皂苷( total saponins of Panax notoginseng, PNS)對由D一半乳糖(D-galactose , D-gal)致亞急性衰老加上鵝膏葷氨酸(ibotenic acid，IBA)損毀腦Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert, nbM)所致的AD大鼠模型的學習記憶能力的保護作用。

 

1實驗材料

1. 1藥品和試劑

PNS:由云南玉溪維和制藥廠提供;石杉堿甲( huperzin A , Hup一A):上海復旦復華藥業有限公司生產(批號:030202 ) ; D-gal:上海恒信化學試劑有限公司生產(批號:20020406 ) ; IBA ; Sigma ChemicalCo. P.0.產品(批號:10k1285)。

1. 2實驗器材

WDT一2型腦立體定位儀:西安西北光電儀器廠生產;Morri。水迷宮設備全套(包括Morri。水迷宮，電腦攝像系統，配套軟件分析系統):北京中科院生理所生產。

2實驗方法

2. 1動物分組、造模與給藥

健康Wistar大鼠90只，其中3月齡15只，為青年對照組(以下稱青年組)。15月齡75只，隨機抽取15只用作正常老年對照組(以下稱老年組)。其余60只大鼠作為造模鼠。大鼠均由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

動物適應性喂養1周后，造模用的60只大鼠腹腔注射0.96% D-gal，生理鹽水(NS)配制，按5 mL/kg體重給藥;青年組和老年組大鼠則腹腔注射等體積NS，每日1次，連續6周。從第7周開始進行腦內雙側nbM核注射IBA。方法:大鼠以3%戊巴比妥鈉35 m歲kg體重腹腔麻醉，將大鼠固定于腦立體定位儀上，在前自后0. 8 mm，中線旁開2. 6 mm,顱骨下8. 2 mm，每側緩慢注射IBA 1 uL ( NS配制，濃度5 g/L)[1]。青年組和老年組在相同腦區內注射等體積NS.2周后，將造模組存活的大鼠隨機分為模型對照組(簡稱模型組),PNS高劑量組(簡稱高劑量組),PNS低劑量組(簡稱低劑量組)和石杉堿甲陽性對照組(簡稱石杉堿甲組)。高劑量組以PNS灌胃，200 mg/kg體重給藥;低劑量組以PNS灌胃,100 m歲kg體重給藥;石杉堿甲組以0. 3 m歲kgHup-A灌胃給藥;模型組、青年組和老年組以等體積NS灌胃。各組均每日給藥1次，連續4周，完成造模和治療。

2. 2大鼠學習與記憶行為測試

采用MWM測試法，進行定位航行試驗和空間探索試驗。MWM參照有關文獻制作[2]。迷宮置于房間的中央，為一圓形不銹鋼水池，直徑200 cm，高50 cm，水深30 cm。將水池等分為4個象限，在象限3中心放置一平臺，平臺為圓形，直徑11 cm，平臺高29 cm(即平臺低于水面1 cm，稱隱藏平臺)。水迷宮正上方2m高處裝有一個小型攝像機，并與另一房間的錄像機和監視器連接，記錄大鼠的游泳軌跡和游泳時間。

(1)定位航行實驗(place navigation ):共進行5d，每天分上下午2個時間段，每一時間段每鼠訓練4次。將大鼠面向池壁由4個人水點放人池中，測其60 s內成功進駐平臺(大鼠找到平臺并滯留其上5s為成功進駐)所需時間(即逃避潛伏期，escapelatency )。如在60 s內大鼠不能成功進駐平臺，則實驗者將其引上平臺并令其停留10s，記錄逃避潛伏期為60s，每次訓練間隔時間為60s。

(2)空間探索試驗( spacial probe test) ; MWM實驗最后1d，撤除平臺，從原平臺象限對側池壁中點將大鼠放人水中，記錄2 min內大鼠在原平臺象限的游泳時間和游泳軌跡，計算大鼠跨躍平臺次數及各象限游泳時間占總時間百分比。

2. 3評價指標與統計方法

定向航行實驗統計量為逃避潛伏期、尋求次數?？臻g探索試驗統計大鼠原平臺象限游泳時間占總游泳時間百分比(簡稱原平臺象限比)、跨越原平臺次數。數據以Sl'SS 11. Sfor Window。統計軟件分析，各組間差異采用重復測量多因素方差分析[3-4]及單因素方差分析，方差齊時用SNK法檢驗，方差不齊時用Game，一Howell檢驗。

3結果

3. 1定位航行試驗

結果見圖1。

由圖1可見，模型組潛伏期Sd內變化平緩，無明顯縮短，給藥治療的各組潛伏期隨著訓練天數的增加而明顯縮短。說明模型組大鼠學習記憶行為能力明顯受損，藥物對癡呆模型均有一定程度的保護作用。以SNK法進一步對各組作兩兩比較，結果見表1.

由表1可見，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，與其他各組相比均具有顯著性差異(P<0.05)，各給藥組與青年組、老年組比較均有顯著性差異(P<0. 05 )。模型組與其他各組的尋求次數差異均具有顯著性(P < 0. 05 )。低劑量組、石杉堿甲組、高劑量組、老年組、青年組尋求次數均值從小到大依次排列，且兩兩相鄰間比較無顯著差異(P>0.05)，不相鄰間各組兩兩比較均具有顯著性差異(P<0.05)03. 2空間探索實驗結果見表2.

由表2可見，組間兩兩比較(SNK法)結果顯示，跨平臺次數除模型組外其他各組兩兩間均無顯著性差異(P>0.05)，而各組與模型組均有顯著性差異(P < 0. 05 )。原平臺象限比模型組較其他各組明顯偏小，差異顯著(P<0.05);給藥各組間及與老年組間兩兩無顯著差異(P>0.05)，而與青年組則均有顯著性差異(P < 0. 05)。

4討論

AD患者的臨床表現為智力減退、近期記憶缺失，以及相關行為能力障礙，因此觀察AD模型及藥物治療效果的重要指標之一，就是對學習記憶進行直接客觀的評價。

MWM實驗是英國心理學家Morri。于20世紀80年代初設計并用于空間學習記憶的大腦機制研究領域[5]。就記憶屬性的不同分類系統來看，經典MWM所檢測的是大鼠在多次的訓練中形成的一種空間參考記憶，其儲存的機制主要涉及邊緣系統及大腦皮層有關腦區，屬于陳述性記憶[3]。臨床健忘或癡呆的患者，正是陳述性記憶首先受損而且比較突出[6]。所以從檢測的記憶屬性來說，運用MWM系統進行防治此類疾病有效藥物的篩選研究是較為恰當的。MWM試驗作為記憶量化的良好方法，其提供的參數眾多，定位航行試驗歷時Sd，實驗數據結構龐大且復雜，為準確反映出各組數據間客觀存在的內在聯系，統計學處理采用胡鏡清等[3]推薦的重復測量多因素方差模型進行分析處理。

研究證實[7] , AD患者nbM膽堿能神經元大量退行變性，因此采用興奮性毒素損毀nbM可獲得理想的膽堿能缺陷AD模型。本實驗采用d-gal加速動物衰老基礎上合并應用興奮性神經毒素IBA損毀大腦雙側nbM核的方法建立AD大鼠模型，在腦組織形態、生化、臨床病理指標上更加貼近AD實際病理改變多因素的復雜過程[8]。實驗結果顯示，模型組大鼠的各指標均劣于其他各組，差異顯著，模型的建立較為成功。

定位航行試驗的Sd訓練中，PNS高劑量組大鼠對平臺的尋求次數明顯提高，較石杉堿甲組及低劑量組差異顯著，接近正常老年組水平。在潛伏期的指標分析中，石杉堿甲組數值上略優于高、低劑量組，但3組統計學處理無顯著性差異?？臻g探索試驗各指標中，各給藥組與老年組間兩兩比較無明顯差別，而與模型組比較均有顯著性差別，說明各藥物的治療均對模型鼠的學習記憶能力起到了改善作用，但結合前面的定位航行試驗指標，還不能認為藥物的保護作用使模型鼠的學習記憶能力恢復到了正常老年鼠水平。空間探索試驗各給藥組間及與老年組間兩兩比較無明顯差異，這可能與大鼠的空間探索策略有關，老年組大鼠對平臺空間位置有較好的記憶，當其數次跨越原平臺位置而未找到平臺時，開始懷疑其記憶，遂進行另外新的探索。對空間探索試驗做探索策略相關指標分析應是有待改進的方法之一。

通過對PNS影響AD模型大鼠空間學習記憶的研究發現，PNS對老年性癡呆模型大鼠學習記憶功能損害有明顯的改善作用，為三七的臨床新用途提供了參考。